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PCR 反应体系各个组份概述
日期：2025-05-02 05:27
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摘要：PCR 反应体系由反应缓冲液（10×PCR Buffer）、脱氧核苷三磷酸底物（dNTPmix）、 耐热 DNA 聚合酶（Taq 酶）、寡聚核苷酸引物（Primer1，Primer2）、靶序列（DNA 模板） 五部分组成，各个组份都能影响 PCR 结果的好坏。
1、反应缓冲液：一般随 Taq DNA 聚合酶供应。标准缓冲液含：50mM KCl，10mM Tris-HCl
（pH8.3 室温），1.5mM MgCl2。Mg2+的浓度对反应的特异性及产量有着显著影响。浓度过高，使反应特异性降低；浓度过低，使产物减少。在各种单核苷酸浓度为 200μM 时， Mg2+为 1.5mM 较合适。若样品中含 EDTA 或其它螯合物，可适当增...
PCR 反应体系由反应缓冲液（10×PCR Buffer）、脱氧核苷三磷酸底物（dNTPmix）、 耐热 DNA 聚合酶（Taq 酶）、寡聚核苷酸引物（Primer1，Primer2）、靶序列（DNA 模板） 五部分组成，各个组份都能影响 PCR 结果的好坏。
1、反应缓冲液：一般随 Taq DNA 聚合酶供应。标准缓冲液含：50mM KCl，10mM Tris-HCl
（pH8.3 室温），1.5mM MgCl2。Mg2+的浓度对反应的特异性及产量有着显著影响。浓度过高，使反应特异性降低；浓度过低，使产物减少。在各种单核苷酸浓度为 200μM 时， Mg2+为 1.5mM 较合适。若样品中含 EDTA 或其它螯合物，可适当增加 Mg2+的浓度。在高浓度 DNA 及 dNTP 条件下进行反应时，也必须相应调节 Mg2+的浓度。一般 以 1.5-2mM（终浓度）较好。
2、dNTP ：高浓度 dNTP 易产生错误掺入，过高则可能不扩增；但浓度过低，将降低反应产物的产量。PCR 中常用终浓度为 50-400μM 的 dNTP。四种脱氧三磷酸核苷酸的浓度应相同，如果其中任何一种的浓度明显不同于其它几种时（偏高或偏低），就会诱发聚合酶的错误掺入作用，降低合成速度，过早终止延伸反应。此外，dNTP 能与 Mg2+结合，使游离的 Mg2+浓度降低。因此，dNTP 的浓度直接影响到反应中起重要作用的 Mg2+浓度。
3、Taq DNA 聚合酶酶：在 100μl 反应体系中，一般加入 2-4U 的酶量，足以达到每 min延伸 1000-4000 个核苷酸的掺入速度。酶量过多将导致产生非特异性产物。但是，不同的公司或不同批次的产品常有很大的差异，由于酶的浓度对 PCR 反应影响极大，因此应当作
预试验或使用厂家推荐的浓度。当降低反应体积时（如 20μl 或 50μl），一般酶的用量仍不小于 2U，否则反应效率将降低。
4、 引物：引物是决定 PCR 结果的关键，引物设计在 PCR 反应中极为重要。
1、反应缓冲液：一般随 Taq DNA 聚合酶供应。标准缓冲液含：50mM KCl，10mM Tris-HCl
（pH8.3 室温），1.5mM MgCl2。Mg2+的浓度对反应的特异性及产量有着显著影响。浓度过高，使反应特异性降低；浓度过低，使产物减少。在各种单核苷酸浓度为 200μM 时， Mg2+为 1.5mM 较合适。若样品中含 EDTA 或其它螯合物，可适当增加 Mg2+的浓度。在高浓度 DNA 及 dNTP 条件下进行反应时，也必须相应调节 Mg2+的浓度。一般 以 1.5-2mM（终浓度）较好。
2、dNTP ：高浓度 dNTP 易产生错误掺入，过高则可能不扩增；但浓度过低，将降低反应产物的产量。PCR 中常用终浓度为 50-400μM 的 dNTP。四种脱氧三磷酸核苷酸的浓度应相同，如果其中任何一种的浓度明显不同于其它几种时（偏高或偏低），就会诱发聚合酶的错误掺入作用，降低合成速度，过早终止延伸反应。此外，dNTP 能与 Mg2+结合，使游离的 Mg2+浓度降低。因此，dNTP 的浓度直接影响到反应中起重要作用的 Mg2+浓度。
3、Taq DNA 聚合酶酶：在 100μl 反应体系中，一般加入 2-4U 的酶量，足以达到每 min延伸 1000-4000 个核苷酸的掺入速度。酶量过多将导致产生非特异性产物。但是，不同的公司或不同批次的产品常有很大的差异，由于酶的浓度对 PCR 反应影响极大，因此应当作
预试验或使用厂家推荐的浓度。当降低反应体积时（如 20μl 或 50μl），一般酶的用量仍不小于 2U，否则反应效率将降低。
4、 引物：引物是决定 PCR 结果的关键，引物设计在 PCR 反应中极为重要。