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PCR反应的控制
日期：2025-05-02 05:27
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摘要：
PCR反应的控制:
1. PCR反应的缓冲液 提供合适的酸碱度与某些离子
2. 镁离子浓度 总量应比dNTPs的浓度高，常用1.5mmol/L
3. 底物浓度 dNTP以等摩尔浓度配制，20～200umol/L
4. TaqDNA聚合酶 2.5U(100ul）
5. 引物 浓度一般为0.1 ～ 0.5umol/L
6. 反应温度和循环次数
· 变性温度和时间 95℃，30s
· 退火温度和时间 低于引物Tm值5 ℃左右，一般在45～55℃
· 延伸温度和时间 72℃，1min/kb(10kb内）
· Tm值=4(G+C) +2(A+T)
循环次数 ：一般为25 ～ 30次...
PCR反应的控制:
1. PCR反应的缓冲液 提供合适的酸碱度与某些离子
2. 镁离子浓度 总量应比dNTPs的浓度高，常用1.5mmol/L
3. 底物浓度 dNTP以等摩尔浓度配制，20～200umol/L
4. TaqDNA聚合酶 2.5U(100ul）
5. 引物 浓度一般为0.1 ～ 0.5umol/L
6. 反应温度和循环次数
· 变性温度和时间 95℃，30s
· 退火温度和时间 低于引物Tm值5 ℃左右，一般在45～55℃
· 延伸温度和时间 72℃，1min/kb(10kb内）
· Tm值=4(G+C) +2(A+T)
循环次数 ：一般为25 ～ 30次。循环数决定PCR扩增的产量。模板初始浓度低，可增加循环数以便达到有效的 扩增量。但循环数并不是可以无限增加的。一般循环数为30个左右，循环数超过30个以后，DNA聚合酶活性逐渐达到饱和，产物的量不再随循环数的增加而增加，出现了所谓的“平台期”